Entre los descubrimientos hechos por el Dr. Rath se destacan los siguientes:

1. El descubrimiento que ateroesclerosis, los ataques del corazón y frota ligeramente es una forma temprana de escorbuto causada por una deficiencia crónica de la vitamina de la pared vascular.
   Leído sobre él en `del libro del Dr. Rath el Heart'. (pdf, MB 1.43)
2. El descubrimiento que la deficiencia de largo plazo de la vitamina es también la causa primaria de la tensión arterial alta, del paro cardíaco, de los problemas circulatorios en diabetes y de otras enfermedades cardiovasculares relacionadas.
   Leído sobre ella en `del libro del Dr. Rath el Heart'. (pdf, MB 1.43)
3. El descubrimiento que el crecimiento y la metástasis del cáncer se pueden prevenir por la fuente óptima de lisina y otras sustancias naturales que bloquean la digestión enzimática del tejido conectivo de las células cancerosas.
   Leído sobre él en el `Cancer'. (pdf, del libro del Dr. Rath kB 655)
4. La fundación de la medicina celular, definiendo la fuente óptima de vitaminas y de otras moléculas de la bioenergía como la brecha médica que permitirá la prevención, el tratamiento y eventual la extirpación de enfermedades mas comunes de hoy.

Publicaciones científicas del Dr. Rath:

Detección y cuantificación de la lipoproteína (a) en la pared arterial de 107 pacientes de puente coronario

Matías Rath, Axel Niendorf, Tjark Reblin, Manfred Dietel, Juan Joaquín Krebber, y Ulrike Beisiegel

 

Diario de la medicina ortomolecular, agosto de 1992

Lipoproteína (a) [el Lp (a)] es una lipoproteína similar a la lipoproteína de la baja densidad (LDL) en su composición de lípido y la presencia de la apoproteína (apo) B-100. En contraste con LDL, Lp (a) contiene una glicoproteína adicional, señalada (a), que es ligado a apo B por los puentes de disulfuro. El diámetro de la partícula es 250 Å, y flota en una gama de la densidad de 1.05 a 1.12 g/ml. El Lp (a) la partícula contiene una alta cantidad de ácido neuramínico debido al (a) altamente glycosylated, 1-44 y solamente algunas áreas de la estructura helicoidal se podrían demostrar en la glicoproteína (a). 5 a pesar de esta capacidad lípido-obligatoria baja, la glicoproteína (a) es parte de una lipoproteína y, por lo tanto, era comúnmente aceptado que debe ser llamado apo (a).
Apo (a) es una proteína de molecularidad elevada del peso con un peso molecular evidente más del kD de 500 en la electroforesis dodecyl del gel del gradiente de la sulfato-poliacrilamida del sodio (SDS-PAGE). 4 que ha sido una heterogeneidad genético resuelta bajo la forma de varias vendas en SDS-PAGE describen. 6.7 la diferencia evidente del peso molecular no se pueden explicar por la mitad ácida siálica. 6 en suero humano fresco, el 95% de apo (a) es lipoproteína asociada. 8
Recientemente, una homología llamativa entre el apo humano (a) y plasminógeno fueron demostrados en ambo acid9, 10 y secuencias amino de la DNA. 11 muestras del suero y del hígado de varias especies eran analizadas para la presencia de Lp (a) pero solamente encontraron a los seres humanos, a los primates, 12 y hedgehogs13 para expresar apo (a).
Lp (a) primero fue demostrado en plasma humana por Blumberg y al.14 y más adelante por Berg y el suyo se asocia. 15 éstos y alteran evidencia proporcionada los estudios que Lp (a) es un rasgo genético cualitativo y cuantitativo. 16.17.18 alrededor 70% de la población normal tienen suero Lp (a) nivela debajo de 25 mg/dl. 19 Utermann y al.6 han postulado que hay una asociación altamente significativa entre el Lp (a) concentración en suero y el diverso apo (a) los fenotipos en SDS-PAGE.
En una serie de estudios epidemiológicos, una correlación positiva del alto suero Lp (a) los niveles con la enfermedad cardíaca coronaria (CHD) han sido demonstrated.20-23 en estudios imunohistochemical, Walton y el apo detectado al.24 (a) en la pared arterial; sin embargo, Lp (a) no era considerado participar en atherogenesis. Hay varios otros estudios, los primeros desde 1958.25 que analizaban extensivamente el tejido arterial humano de la pared para su contenido de la lipoproteína. Ningunos de éstos estudian el Lp incluido (a), y él concentró principalmente en LDL.26-32 Smith y Slater26 observó una relación entre los niveles de lípido del suero y LDL en el intima aórtico de 21 muestras post mortem, y “LDL móviles e inmovilizados” fueron descritos en lesiones ateroscleróticas por Smith y otros 27 para relacionarse la acumulación del apolipoprotein en la pared arterial con el desarrollo de la arteriosclerasis, el intima y las placas normales examinadas 28 y apo cuantificado B de Hoff y otros en rayas grasas arteriales humanas. El trabajo más reciente, publicado por un grupo finlandés, 33 demostró apo b y la e del apo que contenía las lipoproteínas en intima aórtico humano lesión-libre.
En estudios en la interacción posible entre LDL y la pared arterial, se ha demostrado que el atascamiento del Lp (a) a los glycosaminoglycans es más fuerte que el atascamiento de LDL.34 LDL modificado similar, dextrano Lp modificado sulfato (a) causó un aumento de la acumulación del éster del colesterol en amcrophages.35
La puntería de este estudio era investigar una acumulación posible de apo (a) en la pared arterial dependiendo del suero Lp (a) las concentraciones y comparar estos datos a la relación entre el suero y la pared arterial apo B. Hicimos eso por apo de cuantificación (a), apo B, y lípidos en tejido arterial fresco de la pared. Con estos experimentos, quisimos determinar si Lp (a) es un factor de riesgo independiente para CHD.

Métodos

Pacientes, suero y muestras de tejidos
El suero de ayuno preoperativo fue recogido a partir de 306 pacientes (250 hombres. 56 mujeres; edad media, 57 años) que experimentaban cirugía aortocoronary de puente en el departamento de cirugía cardiovascular. Clínica de la universidad de Hamburgo. La sangre fue dibujada sobre la admisión al hospital 48 horas antes de la operación. De los pacientes, los 20% tomaban medicinas de la disminución de lípidos, pero el solamente 3% habían alcanzado valores normales del lípido con el tratamiento. El grupo de control era 72 obreros de una compañía farmacéutica local, que ayunaban y fueron emparejados para el sexo y la edad.
Las muestras de tejido fueron obtenidas a partir del 107 de los pacientes de puente coronario (edad media 59 años): Utilizamos las biopsias tomadas rutinario durante una operación aortocoronary de puente donde el injerto de la vena se ata a la aorta ascendente. Por la investigación histológica, las biopsias demostraron diversos grados de espesamiento íntimo comparados con el tejido del control de recién nacidos. No se examinó ningunas biopsias de las áreas severas de la placa o de las lesiones complicadas. Las muestras venosas fueron recogidas del magna del saphena de la vena, que sirvió como el injerto de puente. El proyecto fue aprobado por la Comisión ética de los médicos de Hamburgo.

Sangre y tejido de Poste-Morten
El tejido post mortem fue obtenido de casos de la autopsia en el plazo de 24 a 28 horas después de la muerte. Las muestras a partir de 11 diversos individuos fueron recogidas de la aorta ascendente y del vástago principal de la arteria coronaria izquierda y exhibieron diversos grados de lesiones ateroscleróticas. Para immunohistochemistry, las muestras fueron recogidas de la arteria coronaria descendente izquierda (CHAVAL). Para ganar un cuadro representativo de la pared arterial, las áreas con o sin las placas fueron utilizadas. Otras muestras fueron recogidas según lo indicado en el texto abajo. No se evaluó ningún suero post mortem sistemáticamente debido a los valores cuestionables debido a la hemólisis y a la dilusión con otros fluídos corporales. Para el estudio de la partícula de la lipoproteína, utilizamos la sangre del pre-mortem de los pacientes obtenida del departamento de química clínica. Estas muestras fueron almacenadas como plasma por no más que 24 horas en la temperatura ambiente antes de probar.

Lipoproteínas, Lipidis, y determinación de la apoproteína
El colesterol era estimado por el uso de “Monotest” (método de CHOD-PAP) de Boehringer Mannheim. Para la determinación del triglicérido. “Peridichrom” (GPO-PAP) de Boehringer Mannheim fue utilizado. El colesterol de la lipoproteína de alta densidad (HDL) fue cuantificado después de la precipitación de las lipoproteínas B-que contenían del apo por acid/Mg fosfotúngstico (Boehringer Mannheim, Mannheim, RFA).
La centrifugación del gradiente de densidad del suero fue realizada según el método de Redgrave y otros 36 que los gradientes de manera gradual fueron acodados como sigue; 3ml del suero ajustó al g/ml de la densidad d=1.21 con KBr; 3 ml de 0.9% NaCl, pH7, ajustaron a g/ml d=1.063 con KBr; 3ml de la misma solución ajustó a g/ml d=1.019; y 1 ml de H2O. La vuelta fue realizada en un rotor de TH-641 Sorvall Du Pont (Wilmington, DE) a partir por de 21 horas, 200 000 g (40 000 RPM) en 4°C. Después de la vuelta, las fracciones de 0.5 ml fueron tomadas de la parte inferior del tubo (fraccionamiento-disposición de Beckmann).
El Lp (a) en los 306 pacientes de puente (el cuadro 1) fue medido usando la inmunodifusión radial (inmuna, Heidelberg, RFA). El Lp (a) el estándar de Heidelberg inmuna fue utilizado para este análisis y ajustado para determinar la proteína fue medido en el Lp aislado (a) y entonces diluido en suero lipoproteína-libre. Los datos en este papel, por lo tanto, describen el apo (a) y apo B [apo b (a) - complejo] en las muestras. El tejido apo (a) era calculado en la asunción que el alrededor 45% de la proteína en el Lp (a) era apo B (Ewald Molinari, GmbH inmuno, Viena, Austria, comunicación personal).
Los 107 pacientes con las muestras de tejido, apo B y el apo (a) en plasma y homogenados del tejido fueron cuantificados con el análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) (véase abajo). En plasma, ambos parámetros también fueron determinados por radioimmunoassy (RIA) de Pharmacia (Uppsala, Suecia). Un suero estándar fue suministrado por Pharmacia para determinar el contenido proteínico total de la partícula, apo (a) y apo B. Este análisis adicional fue utilizado para confirmar los valores de ELISA por otro método disponible en el comercio. Las correlaciones entre RIA y ELISA eran r=0.9 para el apo (a) y r=0.6 para apo B (p<0.001). Los estándares internos en nuestro laboratorio estaban en una gama del 10%. Todos los datos dados en este papel para el suero y el tejido de los 107 pacientes de puente coronario fueron basados en el sistema de ELISA.

Anticuerpos
Producción FO Ployclonal Anti-apo B
El Apo B fue preparado del suero humano LDL. Después de gradiente de densidad, la fracción de LDL fue reducida con mercaptoetanol del 10% (vol./vol.); entonces el SDS sólido fue agregado para arriba hasta el 5% y la muestra fue aplicada a una columna del CL 2B de la sefarosa (los 94x2.6cm para la purificación del apo B. Los anticuerpos fueron levantados en conejos contra este apo purificado B. El antisuero fue purificado por la columna de afinidad de LDL donde apo (a) - LDL libre fue juntado a la sefarosa CNBr-activada. Los anticuerpos purificados fueron conjugados a peroxidase37 y utilizados en el ELISA.
El anti-apo policlonal B de inmuno fue utilizado para el apo B ELISA. Este anticuerpo fue comprobado immonoblotting para saber si hay su especificidad; reconoció solamente el apo B-100, el apo B-48, y los otros fragmentos sabidos de apo B-100. Los anticuerpos monoclonales contra apo B fueron proporcionados amablemente por Yves Marcelo (Montreal, Canadá). Fueron utilizados para controlar solamente la validez de los resultados obtenidos con nuestros anticuerpos policlonales.

Anticuerpos contra Apo (a)
Para establecer el sistema de ELISA, los anticuerpos monoclonales, KO 7 y KO 9 (peroxidasa conjugada) contra apo (a), fueron proporcionados amablemente por Jean-Charles Fruchard (Lille, Francia). 38 para este anticuerpo, demostramos por borrar occidental y ELISA que la reactividad cruzada con plasminógeno era menos de el 5% anti-apo policlonal (a) fue producido en nuestro laboratorio contra el apo purificado (a) (véase abajo) en conejos.
n es paralelo a, nosotros produjo los anticuerpos monoclonales contra el apo aislado (a). La purificación fue realizada por el recentrifugation de la fracción d=1.08 de la densidad a 1.15g/ml en un gradiente de densidad después de la reducción con dithiothreitol.39 dos apo (a) los isoforms, a3 y a5, fueron utilizados para la inmunización (véase abajo). El antígeno fue inyectado en los ratones de Balb C.
Los linfocitos del ratón fueron fundidos con las células del mieloma NSO-1 usando la CLAVIJA 1500 (Boehringer) y el protocolo de Köhler y de las modificaciones Milstein.40 será descrito a otra parte (Beisiegel y otros, observación inédita). Los supernatants del hibridoma fueron defendidos en 96 placas bien cubiertas con el apo (a) o con plasminógeno. El noventa por ciento del apo (a) los supernatants positivos demostraron reactividad cruzada con plasminógeno. Los híbridos que eran específicos para apo (a) subcloned. En este papel, utilizamos el subclone, 8D3.
Todos los anticuerpos monoclonales y policlonales fueron probados en immunoblots, y todos reconocieron los mismos patrones de bandas en 20 pacientes. Los patrones de bandas incluyeron siete vendas: uno más rápido que apo B, uno en la posición del apo B, y cinco sobre la venda del apo B. Los señalamos a1 a a7, del punto bajo al peso de molecularidad elevada.

Homogeneización del tejido
Las biopsias recientemente tomadas fueron aclaradas en el NaCl fisiológico varias veces. El adventitia fue disecado y desechado. Las biopsias eran secas borrado y almacenado en nitrógeno líquido hasta utilizado. Las biopsias fueron cortadas en pequeños pedazos y homogeneizadas en un homogeneizador de cristal del alfarero por 3 minutos con 25 m l almacenador intermediario (10 milímetros Tris/ácido clorhídrico, pH 8.0, conteniendo 154 milímetros de NaCl, el EDTA 1mM, y el tween 20 del 1%) por el peso mojado del miligramo (WW). El homogenado entonces fue centrifugado en 56 000 RPM por 10 minutos en una ultracentrifugadora de Beckmann TL 100 con un rotor TLA-100.2. La pelotilla fue desechada, y el sobrenadante era analizado para la proteína Tween-soluble total de la célula, el colesterol total, los triglicéridos, y el apo Tween-soluble (contenido de a) y del apo B. La proteína era resuelta según el método de Lowry y de al.41 usando la albúmina del suero vacuno como el estándar. Apo B y apo (a) fue medido con ELISA como descrito más abajo. Las muestras de tejido post mortem fueron preparadas de la misma manera. Para el estudio de las partículas de la lipoproteína, un método levemente diverso de la extracción fue aplicado a la pared arterial post mortem. El tejido fue cortado en pequeños pedazos y sacudido suavemente durante la noche en 4°C en 2 ml/g WW del almacenador intermediario descrito arriba, pero sin el detergente. Después de la centrifugación, el sobrenadante fue probado como describe arriba.

Técnicas de ELISA
Determinaciones del tejido
Para la cuantificación de apo B y del apo (a) en los homogenados arteriales de la pared, utilizamos una técnica del emparedado ELISA, una modificación del sistema de ELISA descrito por el Vu-Dac y al.38 para el Apo (a) ELISA, 96 placas bien estuvieron cubiertos con el anti-apo monoclonal (a) (KO7) en una concentración de g/ml de los 25m de noche en la temperatura ambiente. Lavándose, bloqueando, y las dilusiones fueron realizadas en salino phosphate-buffered de 0.1 M (PBS), pH 7.4, conteniendo la albúmina del suero vacuno del 1% (sigma, fracción V) y tween 20 del 1%. Después de lavarse y de bloquear, las muestras homogeneizadas fueron aplicadas en cuadruplicado o duplicado. En el final de la incubación (2hours en 37°C), los homogenados de pozos paralelos (los duplicados y cuadruplican) fueron sacados y reunidos, y los 50m que l de la piscina fue transferido sobre una segunda placa cubierta con anit-apo B (véase abajo). La placa original cubrió con el anti-apo (a) fue lavado, y entonces la mitad de cada sistema de cuadruplica o los duplicados fueron tratados con el anti-apo monoclonal (a) 1:4000 diluido [de KO 9 (conjugación de la peroxidasa)]. La otra mitad fue tratada con nuestro plolyclonal anti-apo B (la peroxidasa conjugó, 1:100 diluido) para determinar la cantidad de apo B asociada al apo (a) [[apo b (a) complejo). Para la cuantificación del apo B, utilizamos el estándar del apo B en una capa del anti-apo B según lo descrito para el apo B ELISA. Las incubaciones con los anticuerpos de la detección fueron realizadas en 37°C por 2 horas. Después de lavarse, el anticuerpo de la peroxidasa de KO 9 fue visualizado con 100 m l de o-phenyldiamine en el almacenador intermediario del citrato de 0.1 M (pH 5.0). La reacción fue parada después de 10 minutos por la adición de 100 m l 1 ácido clorhídrico de N. La peroxidasa del anti-apo B fue tratada como descrita más abajo.
Para evaluar nuestros sistemas de ensayo, utilizamos el tejido post mortem, realizando los triplicados, el intra y los varianaces interassay estaban debajo del 10% para ambas apoproteínas. Esto era particularmente necesario, puesto que en 45 casos, teníamos solamente volúmenes de muestra extremadamente pequeños (menos los de 500m l, de los cuales todas las medidas tuvieron que ser hechas), y no podíamos hacer todas las medidas de ELISA en cuadruplicado en la primera placa. Por lo tanto, no teníamos duplicados para todo el apo final (las medidas de a) y del apo B de todas las muestras de tejido.
La capacidad máxima en el apo (a) ELISA era 35 ng/well, y si permanecíamos en este límite (usando las dilusiones adecuadas), menos el de 5% de apo (a) se podría medir en los homogenados transferidos en un ELISA subsecuente. Las mismas clases de análisis de la transferencia fueron realizadas con las fracciones del suero y de la lipoproteína y de tal modo demostradas ser confiables. Este control era necesario asegurarse de que solamente las partículas B-que contenían del apo fueron transferidas y Lp no residual (a), que no se pudo haber limitado en la primera incubación.
El apo B ELISA fue utilizado para determinar el apo total B en homogenados frescos así como para medir las partículas del apo B que no contuvieron ningún apo (a) en los homogenados transferidos del apo (a) ELISA. Las placas estuvieron cubiertas con los anticuerpos policlonales del anti-apo B (inmunos) en una dilusión del 1:1000. Las incubaciones fueron hechas bajo mismas condiciones según lo descrito para el apo (a) ELISA. El apo B fue detectado usando nuestro anticuerpo policlonal peroxidasa-conjugado del anti-apo B. Mientras que el substrato, phenylenediaminedihydrochloride 1.2 (Boehringer Ingellheim, Garching, RFA) fue utilizado, y, después de 10 minutos, 8 que N H2SO4 fue agregada para parar la reacción.
Con la combinación de estos dos ELISAs, podríamos distinguir entre el apo B ligado al apo (a) [apo b (a) complejo] y apo B no asociado a apo (a). En 32 casos, la suma de estas subfracciones B-que contenían del twoapo era comparable al apo total B según lo determinado por el mismo ELISA (cuadro 3).

Determinaciones del plasma
Para la cuantificación del apo (a) en las muestras del plasma, el mismo ELISAs fue utilizado; sin embargo, no se agregó ningún tween a los almacenadores intermediarios. La cuantificación del Apo B en plasma incluyó 0.05% tweenes 20 en todos los almacenadores intermediarios.
Estándares
Como principio, todos los estándares fueron tratados exactamente la misma manera que las muestras. Para la determinación de apo (a) en las muestras de tejido, por lo tanto agregamos el tween 20 en el estándar, desde entonces que del 1% era la concentración del tween que utilizamos en los homogenados y en todos los almacenadores intermediarios de ELISA.
En el apo (a) ELISA, el Lp (a) el suero estándar suministrado por inmuno fue utilizado. Comparamos el estándar inmuno con el Lp (a) y apo (a) aislado de una piscina del suero. Las muestras aisladas fueron examinadas para su contenido proteínico con el método de Lowry y de al.41 el Lp (a) fue encontrado para estar en buena correspondencia con el estándar con una desviación de menos el de 10% y el apo (a) fueron sobrestimados cerca el alrededor 50% como esperado de usar el “apo b (a)” estándar. Así, para el cálculo de la pared arterial apo (a), puede ser que hayamos sobrestimado el contenido del apo (a), dependiendo del cociente de apo libre (a) en el tejido.
En el apo B ELISA, el estándar del apo B de inmuno fue utilizado cuando las muestras del plasma fueron medidas. Para los homogenados del tejido, preparamos nuestro propio estándar puro del apo B en el tween 20 del 1%. El Apo B fue aislado con cromatografía de columna y delipidated y solubilizado en el SDS. Para el ELISA, el apo B fue dializado extensivamente contra el tween 20 del 1% para reducir al mínimo el contenido residual del SDS y para alcanzar el mismo contenido del tween que las muestras de tejido. El contenido proteínico fue determinado por el método de Lowry y de al.41

SDS- PÁGINA e Immunoblotting
Los homogenados del suero y del tejido delipidated en el 1:1 /vol/vol de la acetona/del etanol). Las muestras fueron preparadas en el ethylmorpholine de 0.02 M que contenía el 5% SDS, reducidas con mercaptoetanol del 10% en 100°C, y aplicadas a una PÁGINA del 8% con 0.1% cross-linker según el método de Neville.42 subsecuente y el immunoblotting fue realizado como describe previamente. 43 las leyendas a las figuras indican qué anticuerpos estaban para la incubación de las manchas blancas /negras.

Métodos morfológicos
Para immunohistochemistry, el tejido fue aclarado en PBS y fijado inmediatamente en formalina PBS-protegido 3.7%. Después de procedimientos estándar, el tejido parafina-fue encajado, corte, y montado en lados de cristal revestidos. Las secciones del material de la autopsia histológico fueron manchadas con la hematoxylin-eosina y la elastica-furgoneta Gieson. Las lesiones fueron clasificadas en la raya grasa, placa fibrosa, de lesiones complicadas según criterios histológicos comunes. La localización de Immunohistochemical de apo B y de apo (a) fue realizada por medio de la avidina-biotina-peroxidasa (ABC) method.44, 45 el conejo policlonal antedicho hormiga-apo B y el conejo anti-apo (a), que fueron producidos en nuestro laboratorio, tan bien como el hormiga-apo monoclonal (a) los anticuerpos (8D3) fueron aplicados a las secciones. Los controles consistieron en el reemplazo del primer anticuerpo con un suero nonimmune de la misma especie.

Métodos estadísticos
Para la evaluación estadística, todos los parámetros con una distribución sesgada, tal como suero Lp (a), tejido apo (a), y apo B, fue transformado logarítmico para las correlaciones. La significación estadística para estos valores era calculada con la prueba de Mann-Whitney U.

Cuadro 1.

Resultados

Los parámetros del lípido del suero a partir de 306 pacientes que experimentaron cirugía aortocoronary de puente y angiographically habían determinado CHD fueron medidos y comparados con un grupo de control de edad comparable de obreros normales (cuadro 1). La comparación de estos grupos demostró diferencias significativas en el triglicérido de suero (p<0.0001) y el colesterol de HDL (p<0.0001). El colesterol de suero total era más alto en el grupo de CHD, aunque no era altamente significativo (p<0.01). Además de los parámetros comunes de la lipoproteína, suero Lp (a) fue medido. En el cuadro 1, el porcentaje de temas con el suero Lp (a) nivela mayor que 25 mg/dl están demostrados (el 16% en controles y el 40% en el grupo de CHD, p<0.0001). Lp (los valores a9 fueron expresados como mg/dl apo b (a) el complejo midió con técnicas inmunológicas. Los valores medios también se dan en el cuadro 1, pero observan que Lp (a) no se distribuye normalmente, según las indicaciones del cuadro 1. La diferencia entre los grupos es confirmada claramente por los valores medios: 14 mg/dl en los controles y 25 mg/dl en los pacientes de puente.
A partir del 107 de los 306 pacientes de puente, obtuvimos muestras de tejido arteriales de la pared de la aorta ascendente a la hora de cirugía. Las muestras de tejido fueron utilizadas para demostrar una correlación posible entre los niveles de la lipoproteína en suero y el tejido arterial de la pared. No se utilizó ningunas biopsias de las áreas severas de la placa, aunque el grado de espesamiento íntimo variara.

Cuadro 1.

Nuestro interés principal era estudiar apo b y apo (a) - contener partículas en el tejido. Una técnica especial de ELISA (descrita bajo métodos) permitió que determináramos la concentración de apo (a), apo (a) - apo ligado B, y apo B no ligado al apo (a) en la misma muestra. Los parámetros de la lipoproteína analizados en las muestras de tejido se dan en el cuadro 2. Observe que la desviación estándar en el cuadro 2 es muy alta, reflejando el hecho de que el lípido y el contenido proteínico en las muestras de la biopsia variadas considerablemente, debido al grado de espesamiento íntimo.
En pacientes con el alto suero Lp (a) nivela, el apo (a) el contenido en biopsias aórticas estaba, tan bien como el apo (a) - apo ligado B, perceptiblemente más arriba que en pacientes con el suero bajo Lp (a). Esto llevó a un aumento de apo total B en la pared arterial de pacientes con el Lp (a) mayor que 25mg/dl. El resto de los parámetros en el cuadro 2 no eran perceptiblemente influencia al lado del Lp (a) nivel del suero.

Cuadro 2.
El cuadro 3 compara el contenido de la lipoproteína de biopsias aórticas a las muestras venosas (n=32). Los valores medios para apo total B y el apo (a) en las venas estaban perceptiblemente más bajos, los 55% y los 27% respectivamente, de los valores aórticos de la biopsia. Los niveles totales del colesterol y del triglicérido eran también mucho más bajos en venas (el 33% y el 73% de los valores aórticos). El cuadro 3 también incluye las medidas para apo B ligado a apo (a) y no ligado al apo (a) (véase los métodos) para las biopsias aórticas. La suma calculada de estos dos valores (los 42.9m g/mg WW). En este subgrupo de pacientes, el 83% del apo B eran apo (a) ligó. Parece, sin embargo, que la cantidad de apo b (a) el complejo varió considerablemente (véase el cuadro 2).
lo los parámetros de la lipoproteína del tejido correlacionaron a los valores de la lipoproteína del suero en el cuadro 4. Los resultados demostrados en esta tabla se confirman en la figura 2A, donde la correlación (r=0.556, p<0.001) entre el suero y la pared arterial apo (a) se demuestra más detalladamente. En cambio, ninguna correlación significativa se podría encontrar entre el suero apo B y la pared arterial apo B, según las indicaciones de la figura 2B (r00.0999, p=NS).

Cuadro 3.
La pregunta siguiente que planteamos era si apo (a) se podría detectar en la pared arterial como proteína intacta o si puede ser que esté ya degrada parcialmente. En el 8% SDS-PAGE y el borrar occidental, apo intacto (a) con su peso de molecularidad elevada normal de t fue visto (el cuadro 3). Además, encontraron a la mayoría de apo immunodetectable B para estar todavía intacta como una venda de la proteína 500-kD (datos no demostrados). Demostramos que el apo (a) el patrón del isoform en la pared arterial correspondió al patrón del suero (cuadros 3.4, y 5). Por otra parte, en 10 muestras arteriales de la pared, separamos las tres capas principales de la pared arterial a fondo lavada y demostradas la distribución siguiente: la mayor parte de apo (a) estaba presente en el intima, había rastros en los medios, y no se detectó ninguno en el adventitia bien-lavado. Estos datos fueron confirmados en 100 preparaciones immunohistochemical, eran apo (a) y los apo B fueron detectados principalmente en el intima.
Las muestras arteriales post mortem de la pared con diversas áreas de la superficie íntima cubiertas con las lesiones ateroscleróticas eran analizadas para determinar la cantidad de los lípidos, apo (a), y apo B en lo referente al porcentaje del área de la placa (cuadro 5). Dividimos las muestras en dos grupos según el área macroscópico visible de la placa (el <50% o el >50%). Incluidas eran 21 muestras de tejido arteriales de la pared de la aorta y de la arteria coronaria izquierda a partir de 11 pacientes. Mientras que los triglicéridos y la proteína no diferenciaron entre los dos grupos, el colesterol, apo (a), y apo B era mayor en el grupo con área de la placa del >50%.

Cuadro 4.
Como en las muestras de puente, quisimos determinar si apo (a) y los apo B estaban todavía intactos como proteínas de molecularidad elevada del peso en el tejido post mortem. El cuadro 4 demuestra que la mayor parte de el apo (a) estaba intacto en su posición de molecularidad elevada del peso respecto al 8% SDS-PAGE. El cuadro 4 también demuestra que el apo (a) el patrón era comparable entre el suero, la aorta, y la arteria coronaria. Por otra parte, en el tejido post mortem, estudiamos el apo (a) el contenido de la aorta ascendente en la localización típica en donde las biopsias fueron tomadas durante cirugía de puente, y nosotros comparamos esto al contenido de la región del vástago (LA) de la arteria coronaria ascendente (RA) y a la izquierda ascendente derecha, así como a la región de ramificación de la arteria coronaria y de la arteria coronaria circunfleja (CX) del CHAVAL. Las diversas secciones de pared arteriales contuvieron cantidades comparables de apo (a) y expresó el mismo patrón del isoform (cuadro 5). Solamente las regiones de ramificación de las arterias coronarias (raya grasa) contuvieron levemente más apo (a). Esta figura demuestra otra vez la ausencia de apo (a) en los medios (compare el cuadro 3).
Immunohistochemistry de la pared arterial post mortem era paralelo realizado al análisis bioquímico. Tres controles demostraron una carencia completa de la coloración (figura 6A) mientras que el apo policlonal y monoclonal (a) los anticuerpos revelaron los resultados comparables (datos no demostrados). Apo B y apo (a) fue encontrado para ser situado exclusivamente en el intima. Las lesiones Atheromatous eran más seriamente afectadas que los segmentos regulares (figura 6B).

Figure2.
Comparar la distribución de apo B y del apo (a), una asociación apretada de ambos fue observado (figuras 6C y 6D). Patrones de apo B y del apo (a) los depósitos eran casi congruentes con una coloración levemente más fuerte para apo B, o emparejado por lo menos en mayores partes. Apo B y apo (a) fue encontrado para ser asociado sobre todo a las estructuras extracelulares en a paquete-como la coloración del patrón (figura 6C y 6D). Sin embargo, en rayas grasas, algunas células de la espuma se podrían identificar como llevar el apo B y/o el apo (a) intracelular (Niendorf y otros, observaciones inéditas).

Figure3.

Para aprender más sobre la forma en la cual apo B y apo (a) se asocia en la pared arterial, nosotros analizaba el tejido post mortem extraído en el NaCl sin el detergente en un gradiente de densidad del KBr. Medimos el colesterol, los triglicéridos, los fosfolípidos, el apo B, y el apo totales y libres (a) en el extracto y en las diversas fracciones de la densidad. El cuadro 7 demuestra la distribución del colesterol, de apo B, y del apo (a) en el gradiente de densidad de extractos aórticos a partir de dos diversas muestras (véase la leyenda). Mientras que no se detectó ningún apo B en la fracción inferior, el 30% a el 40% de apo (a) fue encontrado en esta forma lípido-libre. Había apo B y apo (a) en la gama de la densidad de Lp (a) y LDL, donde la mayor parte de el colesterol fue medido. En otros experimentos, también demostramos que la distribución de triglicéridos y de fosfolípidos fue asociada principalmente al LDL y al Lp (a) las regiones (datos no demostrados).

Cuadro 4.

Cuadro 5.

Cuadro 5.

Cuadro 6.

Cuadro 7.

Discusión

Como fondo para nuestro estudio, analizábamos las lipoproteínas en 306 pacientes de CHD que experimentaron cirugía de puente coronario. En esta cohorte, confirmamos estudios anteriores en las lipoproteínas y CHD. La importancia de la hiperlipidemia como factor de riesgo para CHD se ha confirmado recientemente en un estudio de 40 pacientes de puente que experimentaron un segundo operation.46 además de niveles más altos del suero y de colesterol de LDL, este estudio determinó a los pacientes de CHD tiene valores perceptiblemente más altos 47.48.49 del triglicérido en la mayor parte de los casos asociados a una lipoproteína de alta densidad más baja cholesterol.50
La diferencia más llamativa entre los controles normales y los pacientes de puente en nuestro estudio era el suero Lp (a) llano (p<0.0001). El cuarenta por ciento de los pacientes tenía Lp (a) nivela mayor de 25 mg/dl, mientras que el solamente 16% de los controles sobrepasaron este nivel. Esto apoya la evidencia epidemiológica de otras y de nuestro propio grupo que Lp (a) tiene que ser considerado como particle.51 aterosclerótico sin embargo, hasta la fecha, el fondo patofisiológico para el atherogenicity del Lp (a) no se ha estudiado extensivamente. Mientras que Walton y al.24 detectaron el apo (a) en la pared arterial, no pensaron que participa en atherogenesis.
El nivel de apo (a) en las muestras de tejido arteriales de la pared de 107 pacientes de puente comparados con su suero Lp (a) demostró una correlación fuerte. Ninguna correlación significativa se podía encontrar entre el suero y el colesterol del tejido del suero y del tejido apo B. El apo (a) - apo ligado B demostró una correlación con el Lp (a) como factor de riesgo para el desarrollo de la independiente de la arteriosclerasis de LDL.
Los resultados descritos diferencian de estudios anteriores, 26 que encontraron una relación entre los altos niveles de lípido del suero y LDL en intima aórtico. De acuerdo con nuestros datos, especulamos que la carencia de la correlación entre el suero y el tejido apo B es debido a la degradación intracelular de LDL en la pared arterial.
Si se analizan los valores de la lipoproteína del tejido (el cuadro 2) según el suero Lp (a) de los pacientes (bajo o sobre 25 mg/dl), se consideran dos hechos llamativos: hay una alta correlación entre el alto suero Lp (a) y la concentración del apo (a) en la pared arterial, y hay una considerable cantidad de apo B ligada al apo (a) (el 40% a el 83%) en las biopsias aórticas. Así, alto suero Lp (a) los niveles pueden contribuir perceptiblemente a la deposición de apo B en el arterial todo. Estos datos fueron confirmados por immunohistochemistry; en tejido arterial post mortem de la pared, la mayor parte de el apo B co-fue localizado con apo (a). El hecho de que apo (a), así como apo B, es perceptible sugiere inmunológico que las mayores partes del Lp (a) acumula extracellularly en vez del resumen en las células.
Para probar la sugerencia del immunohistochemistry que apo B y apo (a) pudo todavía ser proteínas intactas, nosotros realizó SDS-PAGE. El Apo B fue encontrado en el kD 513 y apo (a), en la gama del peso molecular alrededor y sobre de apo B; estos pesos corresponden a su peso molecular total normal. Por otra parte, los isoforms descritos para el apo (a) en suero puede ser demostrado en el patrón comparable en la pared arterial. Si es esto una observación general necesita ser evaluada. Apo intacto (a) fue encontrado en las biopsias así como en las muestras post mortem, un hecho particularmente asombrosamente.
Para los experimentos de la cuantificación, comparamos diversos detergentes para la extracción de las muestras de tejido y encontramos que en el tween 20 del 1%, las cantidades mensurables de apo B eran comparables a ésas en el 3% Tritón (TX100), que fue utilizado por Hoff y ambos detergentes al.28 dejó algún apo SDS-soluble B en la pelotilla, pero el almacenador intermediario del tween era levemente superior a Tritón para la detección de apo (a).
El Apo B se ha medido en varios estudios con resultados algo diversos. La cantidad varió entre 2 y 15 mg/g de tissue29,31 seco y 5 a 50 m g/g52 o los hasta 600m g/g tissue.53 seco, 54 los 2 a 15 mg/g fueron descritos para el material humano, mientras que los valores en microgramas por gramo eran de swine54 y monkey studies.52, 53 que detectamos apo B en una gama mala a partir del 40 70 al tejido mojado de m g/g en nuestras muestras de tejido detergente-extraídas con la técnica de ELISA. Nuestros datos correspondieron realmente mucho mejor a los estudios animales y no alcanzaron valores en el radio de acción de miligramos por gramo según lo descrito por Hoff y al.29, 31 para el tejido humano. Sin embargo, consideramos nuestros resultados más razonables puesto que es inverosímil que el contenido del apo B está de la misma orden de la magnitud que la proteína total en el tejido detergente-solubilizado (18mg/g). Creemos que 0.2% para el material aórtico y 0.12% para las muestras venosas son más realistas para el porcentaje de apo B de la proteína total.
Ninguna determinación del apo (a) en la pared arterial se ha publicado hasta ahora. Ylä-Hertuala y al.33 no pudieron detectar el apo (a) en la pared arterial por la inmunodifusión radial (LIBRADA). En base de nuestros resultados, concluimos que el método LIBRADO no es bastante sensible permitir una cuantificación del apo (a) en tejido arterial de la pared.
Cuando el apo (contenido de a) y del apo B de las biopsias aórticas fue comparado con las muestras venosas, valores perceptiblemente más bajos fue encontrado en el tejido venoso. Bajo condiciones fisiológicas, el thee no parecía ser ninguna acumulación comparable de lipoproteínas en las venas. Hoff y otros, 51 sin embargo, demostrado que suero Lp (a) los niveles fueron asociados perceptiblemente al grado de estenosis en vena safena injertan.
En 10 biopsias, así como en muestras de tejido post mortem, disecamos las diversas capas de tejido y analizábamos el intima a parte de los medios y del adventitia. Con métodos bioquímicos e immunohistochemical, demostramos que apo B y apo (a) se localiza principalmente en el intima; había solamente rastros en los medios y no se consideró nada en el adventitia lavado. Por lo tanto, las lipoproteínas deben haber entrado en la pared arterial vía el endotelio algo que siendo contaminaciones del vasorum de los vasos. Con los tejidos post mortem, teníamos la ocasión de estudiar diversas áreas del recipiente y el apo detectado (a) sin diferencias en el patrón individual del isoform. No hemos distinguido todavía cuantitativo las varias áreas.
La pregunta siguiente era si Lp (a) se puede extraer del tejido como partículas de la lipoproteína. En estudios preliminares con la ultracentrifugación del gradiente de densidad, demostramos que el 50% a el 65% de apo (a) era lípido-asociado en la gama de la densidad de 1.05 a 1.1 g/ml, y encontramos el 20% del apo B en esta fracción de la densidad. Detectamos el 70% a el 80% de apo B en la rabia de la densidad de 1.02 a 1.05 g/ml. No se encontró ningún apo B en la parte inferior lípido-libre. Proponemos que éstos LDL-como partículas por lo menos estén derivados en parte del Lp (a) que perdió el apo (a) glicoproteína. El apo disociado (a) fue detectado en la fracción inferior del gradiente. El desmontaje del apo (a) de la partícula puede ser debido a los cambios post mortem en el tejido, porque una disociación similar fue observada en las muestras del suero que habían sido almacenadas en la temperatura ambiente por 24 horas. Esta hipótesis también explicaría la co-localización terminante de apo B y del apo (a) en el immunohistochemistry. No podíamos obtener bastante material de la biopsia para medir el apo libre (a) contenido en tejido arterial fresco de la pared; por lo tanto, no podemos verificar completamente el apo (a) los valores, que eran calculados en la asunción que la mayor parte de el apo (a) estaba en el apo b (a) complejo.
Además del sistema de datos ya discutido, describimos en este papel que algunos resultados preliminares obtuvieron comparando diversas secciones de pared del recipiente en lo referente al área de la placa. La pared junta las piezas con la placa visible más del de 50% demostrada valores considerablemente más altos para apo (a), apo B, y colesterol con respecto a las muestras con área de la placa menos del de 50%. El contenido proteínico y los triglicéridos eran comparables en ambas muestras de tejido. Hoff y al.28 encontraron también cantidades más altas de apo B en aorta normal que placa usando Tritón para la extracción. La definición exacta de los grados de la placa desempeñará un papel importante en la respuesta final a esta pregunta así como los métodos de extracción y de cuantificación.
En conclusión, éste es el primer estudio que demuestra una correlación positiva del Lp (a) el suero nivela con el apo (acumulación de a) y del apo B en la pared arterial. También, la presencia de apo intacto (a) y el Lp (a) - como partículas en pared arterial humana fueron demostrados por primera vez. Asumimos eso en estudios anteriores encendido LDL-como partículas en la pared arterial, el apo (a) se pudo haber faltado y, por lo menos en parte, Lp (a) - partículas semejantes pudo haber sido aislado. Nuestros estudios implican que Lp (a) entra en la pared arterial y acumula extracellularly, donde apo (a) y el apo B se pueden co-localizar con immunohistochemistry. Otros estudios son necesarios definir la manera por la cual Lp (a) entra en la pared del recipiente.

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Fuente: http://www4esp.dr-rath-foundation.org/